利用嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor，CAR) 載體生產(chǎn)可識別腫瘤相關抗原的工程T細胞（也稱為CAR T細胞）已成為一種極富前景的癌癥治療工具。在 CAR T細胞免疫療法中，來自患者（自體）或健康供體（同種異體）的T細胞經(jīng)過改造表達CAR。CAR受體可以靶向識別腫瘤細胞表面抗原，活化T細胞使其發(fā)揮免疫作用以幫助殺傷腫瘤細胞。

CAR受體的結構由四個主要部分組成：（1）一個胞外抗原識別結構域，由已知特異性的抗體的單鏈可變區(qū)片段 (Single chain variable fragment，scFv) 組成。 scFv促進抗原結合，包含一個輕鏈可變區(qū)片段和一個特異的單克隆抗體的重鏈片段，兩者通過一個柔性的肽鏈相連；（2）一個位于胞外的鉸鏈區(qū)或間隔區(qū)，將scFv與CAR的跨膜結構域連接起來，并為CAR的結構提供靈活性和穩(wěn)定性；（3）跨膜結構域，將 CAR 錨定在質膜上，從而將胞外的鉸鏈區(qū)和抗原結合結構域同細胞內結構域關聯(lián)起來。它在增強受體表達和穩(wěn)定性方面起著關鍵作用；（4）胞內信號域，通常源自T細胞受體的CD3 zeta 鏈并包含免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抗原結合CAR后，ITAM被磷酸化并激活下游信號傳導，從而導致T細胞的后續(xù)活化。此外，該胞內結構域還可以引入一個或多個與CD3 zeta信號域串聯(lián)的共刺激域（來源于CD28、CD137等），以改善T細胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的結構在過去幾年中隨著對胞內結構域的修改而不斷發(fā)展。第一代CAR僅包含一個衍生于CD3 zeta鏈的信號域。雖然這種CAR可以激活T細胞，但是由于表達此類CAR的T細胞的細胞毒性和增殖能力偏低，它們在體內的抗腫瘤活性并不理想。第二代CAR除了包含一個CD3 zeta信號域，還具有一個胞內的共刺激域，因此表達第二代CAR的T細胞顯著改善了其體內增殖能力、擴增能力和活化的持久性。為了進一步優(yōu)化CAR T細胞的抗腫瘤功效，第三代CAR除了CD3 zeta外，還引入了兩個胞內順式作用的共刺激結構域。此后，通過修飾胞內結構域以進行誘導表達或組成型表達細胞因子，第四代CAR從第二代CAR開發(fā)獲得。第五代和最新一代CAR也是從第二代CAR衍生而來，整合了細胞因子受體的胞內結構域。

我們的CAR表達慢病毒載體可用于生產(chǎn)慢病毒并高效地向T細胞轉導CAR表達盒。CAR表達慢病毒載體首先在大腸桿菌中進行克隆，其中CAR表達盒包含scFV結構域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內CD3 zeta信號源、共刺激域，并位于慢病毒載體的兩個長末端重復序列（Long terminal repeats，LTR）之間。慢病毒載體構建完成后與輔助質粒一起轉染進入包裝細胞。在包裝細胞中，位于兩個LTR之間的DNA片段會被轉錄成RNA，由輔助質粒表達的病毒蛋白將其包裝形成病毒顆粒。包裝后的活體病毒將會被釋放到上清液中，可以直接收集或進一步濃縮病毒轉染靶細胞。

當病毒轉導靶細胞時，釋放到宿主細胞中的病毒RNA借助逆轉錄酶逆轉錄成雙鏈DNA，然后隨機整合進宿主細胞的基因組中。在病毒載體中，位于兩個LTR的DNA片段和病毒基因組都會穩(wěn)定整合到靶細胞的基因組中。

通過改造優(yōu)化，我們的慢病毒載體刪除了與病毒包裝和轉導相關的基因（這些基因由輔助質粒進行表達，用于病毒包裝過程），使產(chǎn)生的慢病毒顆粒是復制缺陷型的。即包裝的病毒只具有轉導靶細胞的能力，而無法在靶細胞中進行大量復制，因而具有很高的生物安全性。

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的CAR表達慢病毒載體適用于第三代慢病毒系統(tǒng)，可進行第二代CAR表達。經(jīng)優(yōu)化，該載體在大腸桿菌體內具有很高的拷貝數(shù)，包裝的活病毒具有很高的滴度，對大多數(shù)宿主細胞具有高效的轉導能力，能有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現(xiàn)外源基因的高水平表達。

圖1 通過使用表達CAR的Jurkat細胞和表達CD19的靶細胞（Ramos細胞）檢測表面CD69分子的上調，驗證活化的CAR誘導的T細胞。（A）攜帶靶向CD19的CAR基因的慢病毒轉導Jurkat細胞，與表達CD19的Ramos細胞共同培養(yǎng)。與CD19結合的Jurkat細胞被激活，表現(xiàn)出CD69表面抗原上調表達。（B）孵育后流式細胞術分析CAR jurkat細胞的激活程度。與CD19+Ramos細胞（藍色）共同培養(yǎng)后的CAR jurkat細胞顯著增加了CD69的表達量，表明Jurkat細胞在CAR介導下被激活。

CAR表達盒的穩(wěn)定整合：常規(guī)質粒轉染只能實現(xiàn)CAR的瞬時表達，這種質粒會隨著宿主細胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細胞中顯得尤為顯著。相反，慢病毒轉導能穩(wěn)定地將CAR表達盒整合到細胞的染色體中，使其可以長期表達CAR。

滴度高：我們的病毒載體可以包裝出高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務，病毒滴度可以達到>10⁹ TU/ml。在這樣的病毒滴度下，如果選擇合適的劑量去轉導體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞，則轉導效率可接近100%。

高轉導效率：慢病毒對T細胞表現(xiàn)出良好的轉導效率。在開發(fā)基于慢病毒的CAR T細胞時，為達到臨床注射的細胞數(shù)量要求，來自患者的少數(shù)T細胞需要被方便地轉導和擴增。

自定義啟動子：我們的慢病毒載體已經(jīng)過優(yōu)化，其5' LTR的啟動子已進行了自失活。用戶可以自定義啟動子驅動CAR表達。這相對于只能依賴自身5' LTR啟動子驅動CAR表達的MMLV載體來說是一個巨大的優(yōu)勢。

基因拷貝數(shù)相對均一：通常情況下，采用病毒轉導的方式可以比較均一的將外源基因轉入靶細胞中，而傳統(tǒng)的質粒轉染則呈現(xiàn)出較高的不均一性，導致某些細胞會獲得較多拷貝質粒而某些則會獲得較少甚至完全沒有。

體內外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好的體外細胞轉導能力，同樣適用于體內活體動物實驗。

安全性：我們的病毒載體系統(tǒng)具備了以下兩大特點，因而具有非常高的安全性。一、病毒包裝和轉導所必需的基因由三個輔助質粒分開表達。二、5' LTR的啟動子自失活。因此，在進行病毒包裝和病毒轉導的時候不會產(chǎn)生具有復制能力的病毒顆粒，使用我們的載體對人體的健康威脅也是最低的。

載體容量受限：野生型的慢病毒基因組大小約為9.2 kb，而在我們的慢病毒載體中，病毒包裝和轉導的必要元件約為2.8 kb，余下6.4 kb的空間容納客戶的目的序列。當病毒載體超過以上大小限制，病毒的包裝滴度可能會降低。我們的CAR表達慢病毒載體除了CAR序列外，還包含有其他功能性元件如啟動子、抗藥基因等，因此會超過6.4 kb的默認容量限制，導致滴度受到一定影響。

插入突變風險：由于CAR表達慢病毒載體序列可以插入細胞基因組，因此存在一定的插入突變風險。然而對比逆轉錄病毒，這種風險會相對低。逆轉錄病毒的生成的DNA序列有插入基因轉錄起始位點附近和原癌基因的傾向。

技術復雜：使用慢病毒載體時，需要在包裝細胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。因此慢病毒轉染相對于常規(guī)質粒轉染，技術難度更高，周期更長。

高生產(chǎn)成本：生成GMP級別的慢病毒比質粒載體要顯然更高，現(xiàn)已是其中一個限制基于慢病毒的CAR T細胞的臨床應用發(fā)展的主要因素。

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives transcription of viral RNA in packaging cells. This RNA is then packaged into live virus.

5' LTR-ΔU3: A deleted version of the HIV-1 5' long terminal repeat. In wildtype lentivirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that in wildtype virus, the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. On our vector, 5' LTR-ΔU3 is deleted for a region that is required for the LTR's promoter activity normally facilitated by the viral transcription factor Tat. This does not affect the production of viral RNA during packaging because the promoter function is supplemented by the CMV promoter engineered upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response element. It allows the nuclear export of viral RNA by the viral Rev protein during viral packaging.

cPPT: HIV-1 central polypurine tract. It creates a "DNA flap" that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection. This improves vector integration into the host genome, resulting in higher transduction efficiency.

Promoter: The promoter driving your downstream CAR expression cassette is placed here. 

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

CD8-leader: Leader signal peptide of T cell surface glycoprotein CD8 alpha chain. Directs transport and localization of the protein to the T cell surface. 

scFv: Single chain variable fragment derived from a monoclonal antibody of known specificity. Recognizes cells in an antigen-specific manner. 

Hinge: Extracellular hinge region of the CAR. Connects scFv with the transmembrane region providing stability and flexibility for efficient CAR expression and function; enhances efficiency of tumor recognition; improves expansion of CAR T cells. 

Transmembrane domain: Transmembrane domain of the CAR. Anchors the CAR to the plasma membrane and bridges the extracellular hinge as well as antigen recognition domains with the intracellular signaling region; enhances receptor expression and stability. 

Costimulatory domain: Intracellular costimulatory domain of the CAR. Improves overall survival, proliferation, and persistence of activated CAR T cells. 

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response. 

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. It enhances viral RNA stability in packaging cells, leading to higher titer of packaged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

3' LTR-ΔU3: A truncated version of the HIV-1 3' long terminal repeat that deletes the U3 region. This leads to the self-inactivation of the promoter activity of the 5' LTR upon viral vector integration into the host genome (due to the fact that 3' LTR is copied onto 5' LTR during viral integration). The polyadenylation signal contained in 3' LTR-ΔU3 serves to terminates all upstream transcripts produced both during viral packaging and after viral integration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It further facilitates transcriptional termination after the 3' LTR during viral RNA transcription during packaging. This elevates the level of functional viral RNA in packaging cells, thus improving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.